Séquençage d’anticorps de novo

Il existe de nombreux cas où le séquençage classique des anticorps à partir d’une lignée cellulaire d’hybridome n’est pas possible. Si vous possédez même moins de 1 mg de votre anticorps (pureté >90%), ProteoGenix peut déterminer sa séquence exacte grâce à notre service de séquençage d’anticorps de novo. Notre plateforme de pointe de séquençage de novo des protéines d’anticorps combine les dernières technologies de spectrométrie de masse et les logiciels les plus avancés pour le séquençage de novo des protéines. Notre procédure standard comprend :

• Digestion enzymatique de la protéine de l’anticorps pour obtenir de courts peptides se chevauchant.
• LC-MS/MS de chaque peptide.
• Traitement des données comprenant l’identification de novo des peptides et l’assemblage automatique des peptides superposés.
• Livraison d’un rapport complet sur le séquençage des protéines d’anticorps.
• Facultatif : test d’expression + test d’interaction anticorps/antigène

En tant qu’expert en production d’anticorps, ProteoGenix peut retraduire la séquence d’acides aminés connue en un gène et l’utiliser comme matériau de départ pour l’expression transitoire ou stable de votre anticorps. Cela peut faire partie d’un processus complet de développement d’anticorps, y compris l’optimisation de la production. Pour obtenir plus d’informations sur nos capacités, contactez nos responsables de comptes.

La distinction entre leucine et isoleucine est particulièrement importante dans le contenu du séquençage d’anticorps de novo. En effet, le remplacement d’une leucine par une isoleucine et vice versa dans la région CDR ou à proximité de celle-ci peut avoir un impact considérable sur l’affinité et la spécificité de votre futur anticorps recombinant.
Pendant longtemps, la dégradation d’Edman a été considérée comme la meilleure approche pour le séquençage des anticorps et pour la détermination de la leucine/isoleucine. Cependant, les techniques modernes de SM sont plus sensibles, plus rapides (et donc moins chères) et permettent la caractérisation de peptides plus longs et même modifiés. Le principal problème de cette technique est qu’elle ne permet pas une bonne discrimination isoleucine/leucine. Les technologies de fragmentation avancées telles que la dissociation par collision à haute énergie avec transfert d’électrons résolvent ce problème en générant des ions w différents pour la leucine et l’isoleucine :

• L’ion z. avec la leucine est transformé en ion w par perte de radical isopropyle.
• L’ion z. avec l’isoleucine sur son extrémité N-terminale est transformé en ion w par perte de radicaux éthyle ou méthyle.

Par conséquent, les ions w formés par la fragmentation des chaînes latérales de la leucine et de l’isoleucine sont caractérisés par une masse différente et deviennent distinguables par spectrométrie de masse. Cette technique couplée à la spécificité de l’enzyme de digestion classique et à l’analyse statistique des séquences homologues dans la base de données des anticorps permet d’attribuer un résidu d’acide aminé à chaque position avec une grande confiance.
Notre détermination de la leucine/isoleucine tient compte de tous ces paramètres. Il en résulte une caractérisation de la séquence de l’anticorps avec une précision inégalée, même dans la région CDR.

Le séquençage d’anticorps de novo consiste à dériver la séquence d’acides aminés d’un anticorps sans avoir besoin d’accéder à un ARNm ou à une lignée de cellules d’hybridome. L’idée principale du séquençage de novo est d’exploiter la différence de masse entre deux ions de fragment pour déterminer la masse d’un résidu dans une séquence peptidique. Comme la plupart des acides aminés sont caractérisés par une masse unique (sauf la leucine et l’isoleucine), il est théoriquement possible de déduire la séquence peptidique.
En pratique, l’interprétation des spectres MS/MS commence par l’attribution des ions y et b. Cela nécessite l’interprétation d’un expert humain ou d’un logiciel de séquençage de novo. Pendant longtemps, le séquençage de novo des anticorps a été considéré comme un processus qui prenait beaucoup de temps. Cependant, les progrès récents des algorithmes informatiques tels que PEAKS ou NOVOR ont considérablement augmenté les performances de l’analyse des spectres MS/MS bruts, même si certaines difficultés subsistent. Ces difficultés sont de nature différente :

• Présence de modifications post-traductionnelles conduisant à une attribution de masse difficile
• Présence de résidus de masse similaire (comme la leucine et l’isoleucine)
• Présence de pics de bruit
• Absence d’ions fragmentés

et peut conduire à des incertitudes dans la caractérisation du peptide, et donc de la séquence correcte de l’anticorps.
Grâce aux dernières technologies de séquençage d’anticorps de novo, ProteoGenix est en mesure de surmonter toutes ces difficultés et de garantir une précision de séquence d’au moins 90 %. Vous devez séquencer votre anticorps ? Contactez nos chargés d’affaires et laissez-nous porter votre projet.