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Expression de plus de 1500 protéines- 20 ans d’expertise
- De la synthèse des gènes à l’expression des protéines
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- Expression de plus de 1500 protéines
- 20 ans d’expertise
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Obtenez un rendement élevé d'expression de protéines dans un système eucaryote à un prix abordable ! Faites confiance à nos experts pour optimiser tous les paramètres et faire exploser le rendement de votre expression de cellules d'insectes !
Pourquoi choisir ProteoGenix pour votre
expression de protéines par baculovirus ?
Accéder à une boîte à outils complète
Nous proposons une grande variété de lignées cellulaires et de vecteurs d’expression pour optimiser l’expression de vos protéines de cellules d’insectes.
Une expertise inégalée en matière d'expression des protéines
Nous effectuons couramment l’expression des protéines depuis 2003. Plus de 1500 protéines ont été exprimées à ce jour.
Protocoles optimisés
Notre service d’expression de protéines par baculovirus comprend l’optimisation de plusieurs paramètres tels que le choix de la lignée cellulaire d’insecte, la multiplicité de l’infection et le temps d’incubation.
Solutions intégrées
Choisissez un partenaire unique, de la synthèse des gènes à l’expression des protéines.
Optimisation des codons
Profitez de l’expertise de ProteoGenix en matière de synthèse de gènes pour obtenir un gène optimisé pour l’expression des cellules d’insectes.
Chargés de projets de niveau PhD
Chez ProteoGenix, vous bénéficiez immédiatement de l’expertise d’un chargé d’affaires de niveau doctoral !
Notre procédé d'expression de protéines sur cellules d'insectes
- Construction du vecteur d’expression (facultatif)
Design de gènes incluant une optimisation de codons
Synthèse de gènes
Sous-clonage dans un vecteur d’expression
- Production et amplification du virus
Transformation du plasmide dans des cellules E. coli compétentes pour générer l’ADN du bacmide.
Transfection de cellules d’insecte avec le Bacmid recombinant
Génération de la souche de baculovirus P1
Amplification du baculovirus (stock P2)
Détermination du titre du virus
- Expression de protéines à petite échelle
Transfection et sélection des clones de levure
Détermination des clones les plus expressifs
Optimisation de l’expression
SDS/page + WB si nécessaire
Tests de purification
- Expression des protéines, mise à l’échelle et purification
Expression et purification des protéines avec des conditions optimisées déterminées précédemment.
Notre procédé pour l'expression des cellules d'insectes
| Étape | Contenu | Délai | Livrables |
|---|---|---|---|
| Production et amplification du virus |
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3 à 4 semaines |
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| Mise à l’échelle de l’expression des protéines |
|
2 semaines |
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| Production et amplification du virus |
|
3 à 4 semaines |
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Options
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Étude de cas :
Exemple de production d'une bêta-glucosidase par des cellules d'insectes
SERVICE EFFECTUÉ
Un client nous a demandé de produire une protéine recombinante de bêta-glucosidase en utilisant un système d’expression baculovirus (production de cellules d’insectes). Notre client a commandé un ensemble complet de cellules d’insectes, comprenant des tests d’expression et de purification à petite échelle, suivis d’une production et d’une purification pilote de 1L. Nous avons atteint un rendement de 370 mg/L et livré 60 mg après une expression à petite échelle. La production pilote de 1L n’était plus utile et n’a donc pas été facturée à notre client. Les services réalisés comprenaient :
-
Sous-clonage dans le vecteur d’expression BV
-
Tests d’expression et de purification des protéines recombinantes
BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
L’ADNc codant pour la protéine bêta-glucosidase a été synthétisé chimiquement après optimisation de la séquence pour l’expression dans des cellules d’insectes. Il a ensuite été sous-cloné dans un vecteur d’expression propriétaire. Une séquence codant pour une étiquette 6His a été ajoutée pour une purification supplémentaire.
TESTS D'EXPRESSION
GÉNÉRATION DU STOCK DE VIRUS P1
Figure 1. Analyse de l’expression des cellules d’insectes pendant la génération P1.
A gauche. Coloration au bleu de Coomassie. Bien. WB avec anticorps anti-His (substrat ECL) « -« . Non transfecté
culture témoin. 1 et 2 sont des transfections avec 2 clones de Bacmid différents.
Conclusion de l’étape de génération du virus P1
Une bande protéique correspondant au poids moléculaire de la protéine bêta-glucosidase est observée par SDS-PAGE dans des extraits de protéines natives. Ce résultat est confirmé par Western blot (Figure 1, flèches vertes). Le clone No1 du bacmid recombinant a été utilisé pour les tests d’expression.
TESTS D'AMPLIFICATION ET D'EXPRESSION DU VIRUS
Figure 2. Tests d’expression des protéines avec le stock P2.
Coloration au bleu de Coomassie. A gauche. Type de cellule 1. Droite. Cellule de type 2. « -« . Culture de contrôle négatif.
Conclusion des tests d’expression
Les tests d’expression avec P2 confirment que la cible est présente à un niveau élevé dans les extraits de protéines natives (Figure 2, flèches vertes). Conditions optimales pour l’expression native : Figure 2, flèche rouge = loi
TESTS DE PURIFICATION
Figure 3. Test de purification des protéines à petite échelle. Coloration au bleu de Coomassie.
A gauche. Profil de purification. Bien. CQ final du pool de purification
IN. Entrée. FT. Passez à travers. W1-W3. Les étapes du lavage. E1-E9. Fractions éluées.
Conclusion des tests de purification à petite échelle
La protéine bêta-glucosidase recombinante peut être produite et purifiée dans des conditions natives. La pureté est ≥ 95%, et le rendement de production/purification est d’environ 370mg/L. Le système d’expression du baculovirus était un choix parfait pour cette protéine.
Quels sont les avantages de l'expression protéique
en cellules d'insectes?
Les systèmes d’expression du baculovirus sont des systèmes d’expression eucaryotes. Ceci confère à ces systèmes tous les avantages de leur nature eucaryote tels que :
-
Le repliement correct des protéines : les cellules d’insectes intègrent l’ensemble de la machinerie de repliement des protéines caractéristique des systèmes d’expression eucaryotes. Le baculovirus est le système d’expression le plus couramment utilisé pour l’analyse structurale (par exemple, la détermination de la structure 3D des protéines).
-
Modifications post-traductionnelles : les systèmes d’expression du baculovirus sont capables d’effectuer des modifications post-traductionnelles telles que des glycosylations et des phosphorylations. Ces modifications confèrent des propriétés de solubilité améliorées à la protéine exprimée par rapport à la production de protéines d’E.coli et sont très proches de celles que l’on trouve dans les cellules de mammifères.
-
Capacité à exprimer de grands complexes protéiques de protéines de mammifères.
Ils comportent même des avantages uniques par rapport à d’autres systèmes eucaryotes, tels que :
-
Niveau élevé d’expression des protéines (même si des rendements protéiques plus élevés pourraient être obtenus en utilisant E. coli de la levure.
-
Coût inférieur à celui de l’expression des protéines de mammifères.
En conclusion, l’expression dans des cellules d’insectes représente la meilleure option pour les chercheurs et les entreprises désireux de produire leur protéine dans un système d’expression eucaryote (avec des profils de glycosylation proches de ceux obtenus dans des cellules de mammifères) à un prix abordable.
Optimisation de l'expression protéique
dans le baculovirus
De nombreux facteurs influencent le rendement de l’expression des protéines des baculovirus. L’une des plus importantes est la multiplicité de l’infection (MOI). La multiplicité de l’infection fait référence au nombre de virus à ajouter aux cellules.
Il existe principalement deux procédés utilisés pour l’expression des protéines du baculovirus :
-
Processus à faible MOI : ce procédé fait référence à un processus d’infection par baculovirus en deux étapes. Dans la première phase, les cellules sont inoculées avec une MOI<1, ce qui n’entraîne qu’une infection partielle de la culture cellulaire. Cela signifie que les cellules non infectées continuent de proliférer et que les cellules infectées produisent la protéine recombinante et de nouvelles particules virales. Dans ce cas, une seconde infection est nécessaire, ce qui permet d’obtenir une culture cellulaire infectée à haute densité. Cette méthode entraîne des processus plus longs mais augmente généralement le rendement de l’expression des protéines, car davantage de cellules sont disponibles pour produire la protéine recombinante.
-
Procédé à forte MOI : l’infection par baculovirus à MOI élevée correspond à un processus en une étape où une quantité excessive de virus (MOI>1) est ajoutée à la culture cellulaire.
Le rendement de l’expression des protéines des cellules d’insecte peut également être amélioré en optimisant le temps d’incubation. Le but de cette étape est de déterminer à quel moment de l’incubation la culture cellulaire doit être récoltée. Fondamentalement, la culture cellulaire doit être récoltée avant que la dégradation des protéines ne commence.
Comme chaque projet représente un défi unique, ProteoGenix teste plusieurs lignées cellulaires, la multiplicité des infections, les temps d’incubation et les milieux de culture (sur demande). Contactez notre responsable de compte PhD pour obtenir votre offre personnalisée.
Expression par baculovirus :
principe du système
Le système d’expression du baculovirus est basé sur l’infection de cellules d’insectes par le baculovirus. Les baculovirus sont des agents pathogènes des insectes qui contrôlent la population d’insectes dans la nature. Ils présentent un cycle de réplication biphasique dirigé par deux formes du virus :
-
Virus bourgeonné : forme nécessaire pour l’infection d’une culture cellulaire d’insecte.
-
Virus dérivé de l’occlusion composé d’une grande quantité de P10 et de polyédrine.
Cette dernière forme du virus n’est pas nécessaire pour l’infection des cultures de cellules d’insectes. Ainsi, les promoteurs polh et p10 peuvent être exploités pour l’expression de protéines recombinantes. C’est la base du système d’expression du baculovirus.
